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猪繁衍与呼吸综合征确诊本事的切磋进展

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猪繁衍与呼吸综合征确诊本事的切磋进展

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猪繁殖与呼吸综合征由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种以感染妊娠母猪晚期流产、产死胎、早产、木乃伊胎和弱胎,各种年龄猪呼吸障碍、厌食为特征的高度传染性疾病,在美国最早发生该病。荷兰人Wensvoot等1991年首次于发病仔猪和母猪体内分离到了该病毒,当时被称为Lelystad病毒。随后很多国家也相继分离到此病毒。郭宝清等首次从国内有相似症状发病猪群中分离出猪繁殖与呼吸综合征病毒,从此代表该病在我国的存在。杨汉春阐述PRRSV有2个血清型,即美洲型(代表毒株为VR-2332株)和欧洲型,欧洲和美洲分离株毒株之间存在明显的抗原差异性。在对我国分离毒株的基因组进行分析表明,目前在我国流行的毒株均属于美洲型,并没有发现和分离到欧洲型毒株。汤德元等分析了美洲型的PRRSV,其可分为4个亚群,我国现今流行的PRRSV毒株属于四个亚群中的3个亚群,即以PRRSV BJ-4株为代表的属于1亚群;以HB-1/2002、CH-la和HB-2/2002株为代表的属于2亚群;以BJ-13为代表的属于4亚群。本病传播迅速,尤其在养猪技术进步和经济发达国家,由于猪群密集、流转频繁,更易引起流行。目前,各国对本病进行了大量深入的研究。PRRS可危害各种日龄阶段的猪,并且临床表现多样,同时引起细菌病或病毒病等继发感染,导致临床症状的复杂化。因此,仅根据临诊症状及流行病学特点很难做出诊断,此病的诊断必须借助于实验室诊断技术。本文主要对近年来实验室对猪繁殖与呼吸综合征诊断方法的进展进行综述,以期为猪繁殖与呼吸综合征的诊断与防控提供一定的理论支持和参考。1 病毒的分离鉴定

病毒的分离鉴定是目前病毒病最真实的一种诊断方法。常用于PRRSV分离的细胞主要有猪肺泡巨噬细胞、非洲绿猴肾细胞(MA-104、CL-2621、Marc-145等),以及克隆自Marc-145的更敏感的HS.2H细胞。但分离PRRSV欧洲株只能用PAM细胞。该病毒的分离可来源于血清、肺脏、肺泡灌出物、脾脏、淋巴结和扁桃体,尤其以血清和肺脏组织分离成功率最高;较易从急性感染病例猪中分离到PRRSV;据有关报道PRRSV在死胎和新生仔猪中分布情况不一致,流产在死胎脾脏和淋巴结巨噬细胞分布含量比较多,而新生仔猪则常见于肺脏。采集后的样品应冷藏或冷冻运输和保存,将采集的样品经过处理后接种于长满的单层PAMs细胞后1~4 d即可出现细胞病变,细胞最初呈现灶状变圆、膨大,随后皱缩,脱落形成拉网空洞。当接种于CL-2621细胞时,CPE出现得比较缓慢,需在感染后2~6 d才会侵染细胞单层。PRRSV在接种于Marc-145细胞48 h即可出现典型的CPE变化,具高度敏感性。由于致病力的不同,不同分离株在细胞培养上生长情况各异,甚至有些病毒株并不出现CPE现象,与此同时,必须同时结合间接免疫荧光试验和免疫过氧化物酶单层试验等病原检测方法进行验证。

2 血清学诊断方法

血清学试验是一种相对较于传统的PRRSV诊断方法,在病毒抗原和抗体的检测用得比较广泛。血清学实验有其较强的特异性,但在敏感性上有所欠缺。

2.1 中和试验

在对PRRSV抗体进行检测的过程,中和试验对PRRSV的抗体特异性是很好的,但是由于中和抗体出现的时期比较晚,需在感染后4~5周才能首次检测到VN抗体,感染后的10周达到最高,在大部分的临床检测PRRSV新近病例中,与IPMA、IFA、ELISA作比较其敏感都低于它们,所以SN不适用于对PRRSV感染的早期诊断。Yoon等对中和试验进行了改良,其改良内容是加入20%的猪新鲜血清增加补体的量,目的是为了提高检测敏感性,在感染后9~11d即可检出较高滴度的VN抗体。但该方法也对环境、人员的技术要求高,目前也大多局限在实验室做研究用。

2.2 酶联免疫吸附试验

Albina等将PRRSV接种在PAM细胞上,以制备阳性抗原和模拟抗原,首次建立了检测PRRSV抗体的间接酶联免疫吸附试验,许多结果表明ELISA具有与IPMA一样的特异性,并且敏感性更高,如今商品化的间接ELISA诊断试剂已在全球范围内广泛使用。罗长保等将ATCCVR-2332株接种Hs.2H细胞,制备抗原,以血清抗体与模拟抗原反应的d450nm值作为标准,从而建立了用于血清中PRRSV抗体的间接ELISA方法,实验结果显示,有着与IFA相同的特异性,更高敏感性。王刚等用差速离心法提纯抗原,以NC膜做载体,成功地建立了Dot-ELISA,并与IFA具有相同的特异性,敏感性高于IFA。仝利剑等建立抗体双抗原夹心ELISA方法,利用此重组融合N蛋白建立了一种检测PRRSV特异性抗体的双抗原夹心ELISA,并通过与商品化试剂盒的应用比较对该方法进行了系统评价。分析了来自北京、山东、河南、河北4省区多个养猪场的近300份血清,总体的特异性和敏感性都较高。就目前看来,ELISA方法快速灵敏,特异性和敏感度均较高,操作简便,结果能自动显示,对于大批量血清样品的检测也实用。

2.3 间接荧光抗体试验

间接荧光抗体试验与免疫过氧化物酶单层试验具有一样的特异、敏感性,如今在欧洲和北美的许多国家得到了普遍的使用。在我国也有自己生产的IFA和微量IFA诊断试剂盒供应。可以从感染6d后的猪体内检测到PRRSV抗体,在30~50d时抗体达到峰值,随后逐渐降低,直至4~6个月后抗体消失,但该方法需要进行细胞培养,需用倒置显微镜观察,结果不能自动显示,对所需环境和人员的要求高,不适合大规模监测;并且,IFA与IPMA只能检测出与实验用PRRSV抗原性相近的PRRSV分离株。

2.4 免疫过氧化物酶单层试验

免疫过氧化物酶单层试验方法是历史最长的检测PRRSV抗体的方法,在欧洲国家被普遍使用,IPMA具有较高的敏感性和特异性,能在病毒感染6 d后猪体中检出PRRSV抗体,该方法是基于PAMs、Cl-2621、Marc-145等细胞系上进行完成的,不好的是由于母猪血清和4周龄内的仔猪血清可以与对照的巨噬细胞反应,导致背景着色,从而影响结果的判定,且结果不能自动显示,具一定的主观性;同时还需细胞培养和倒置显微镜观察,费力费时,大规模检测费高,也不利于推广应用。

2.5 乳胶凝集试验

王忠田等利用纯化的PRRSV重组M蛋白致毒乳胶制成乳胶抗原,成功地将LAT用于PRRSV血清抗体的检测,具有良好的特异性。用LAT与IDEXX公司抗体检测试剂盒同时对76份猪血清样本进行检测,结果表明LAT的特异性和敏感性均为95%,与IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒的总符合率为87%,检出率基本一致。因LAT具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点,是一种适合基层检测PRRSV血清抗体的新方法。

2.6 胶体金抗体检测技术

崔尚金等建立猪繁殖与呼吸综合征胶体金抗体检测技术,运用胶体金标记纯化后的PRRSV基因工程表达抗原,以一种微孔滤膜为固相载体,以红色胶体金为标记物的检测PRRSV抗体的胶体金免疫层析法。特异性交叉试验证明,GICA检测PRRSV抗体有较高的特异性,与其他方法对比检测证实了其敏感性,生产了一批免疫胶体金试纸条,检测36份临床样本,其中30份经免疫胶体金试纸条及ELISA、免疫荧光检测均为阳性。猪繁殖与呼吸综合征免疫胶体金抗体检测技术的建立为检测PRRSV抗体提供了一种快速简便的方法。当然,目前国内一些大专院校也建立了更为方便、快速的诊断方法,如乳胶凝集试验和间接血凝试验,但其在敏感性、特异性和试剂的重复性、稳定性上均有待提高。

3 PRRSV的分子生物学诊断

3.1 RT-PCR检测

PRRSV的RT-PCR检测在许多研究及检测诊断实验室已普遍使用,且敏感度达到了pg水平。Suarez等建立了检测PRRSV的RT-PCR方法,该方法敏感性好,并可检出隐性感染。Mar-Dassi等通过设计特异性的上下游通用引物,建立了鉴别诊断北美加拿大株和欧洲株PRRSV的RT-PCR诊断方法,该方法在组织中检测时敏感性高于IFA敏感性。赵耘等建立的检测PRRSV的套式RT-PCR法,其敏感性与RT-PCR法相同,且操作更简单。顾海洋等根据猪高致病性蓝耳病与低致病性蓝耳病在NSP2基因上有87bp连续缺失,从NCBI上下载7对猪高致病性蓝耳病保守序列设计一对引物。通过RT-PCR方法进行检测证明实验室所保存的这两株毒株分别为猪高致病性蓝耳病和低致病性蓝耳病,并且建立了猪高致病性蓝耳病与低致病性蓝耳病的检测方法。

3.2 实时荧光定量PCR

在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术可定量PCR。实时荧光定量PCR技术(real time fluorescent quantitativePCR,FQ-PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,它的原理是在PCR反应体系中添加合适的荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程,随后利用标准曲线对未知目的片段进行定量分析的手段。该方法不仅实现了对DNA模板的定量,并且具有高灵敏度、特异性和可靠性更强、自动化程度高、实时性和准确性等特点,如今已普遍用于分子生物学研究和医学研究等各类领域。

在外国,实时荧光定量PCR技术在动物疫病的临床诊断方面应用也十分广泛。Callahan等建立的real-time RT-PCR技术可以用于检测猪精液、血清及各类组织中的PRRSV,省时省力且敏感度高于常规RT-PCR。Martinez等优化改良了的PRRSV SYBR Green I时RT-PCR检测方法,具有很高的特异性和敏感性,其检出量为101.52TCID50/样品,并通过TM值和溶曲线分析基因型,能够很好地鉴别美洲株和欧洲株PRRSV毒株的基因型。

王宗照等根据Genbank中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR Green I实时PCR检测HP-PRRSV的方法。结果表明,该方法能够检测到HP-PRRSV的存在,不与其他猪源病毒发生非特异性反应。与常规PCR方法相比,两者的符合率为100%。该方法具有快速、简便、敏感等优点。王荣等根据Genbank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因序列设计1对特异性保守引物,扩增位置在M基因的14744-14846位,长度为103 bp。提取PRRSV的RNA,并反转录成cDNA,以此cDNA为模板建立了SYBRGreen I实时定量PCR检测PRRSV的方法。并用该方法检测送检的临床疑似病料,试验结果表明,本研究建立的PRRSVSYBR Green I PCR特异性强,耗时短,操作简单。刘长龙等为快速检测PRRSV,针对其N蛋白基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA作为标准品,设计并改良检测PRRSV的Taq MAN荧光定量PCR方法。应用该方法检测除猪繁殖与呼吸综合征病毒以外的猪病病原,结果均呈阴性;针对PRRSV阳性RNA的测试敏感度可达到10拷贝,比普通PCR灵敏10~100倍,结果表明该实验建立的PRRSV Taq Man荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。

3.3 依赖核酸序列的扩增技术

NASBA即依赖于核酸序列的扩增,是一种扩增RNA的新技术,是由1对引物引导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在42 ℃进行,可在2h左右将模板RNA扩增约109倍,不需特殊的仪器。梁海霞等针对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF1中编码nsp2的基因序列设计引物,创建了NASBA方法,并联合微孔板中液相杂交与酶标显色反应检测NASBA扩增产物,建立了检测高致病性PRRSV的NASBA-ELISA。琼脂糖凝胶电泳表明,NASBA方法扩增出了特异性核酸阳性条带。将NASBA产物RNA系列稀释后同时进行了ELISA和Northern杂交。结果显示,ELISA和Northern杂交最高可分别检测到1:50和1:30稀释的产物RNA。采用建立的NASBA-ELISA可检测到101.83TCID50/Ml的Hun4株PRRSV。该方法只对3株高致病性PRRSV的检测结果为阳性,对经典株PRRSV和其他猪源病毒的检测结果均为阴性。结果表明,NASBA-ELISA能够敏感并特异地检测高致病性PRRSV,预示NASBA在PRRSV检测上应用前景广阔。

3.4 原位杂交技术

Suarez等以PRRSVRNA为模板,通过RT-PCR扩增和地高辛标记,制备了ORF7433bP cDNA地高辛探针,对试验感染猪的肺脏、淋巴结和肾脏进行了原位杂交,检测到了PRRSVRNA,较免疫组化具有更高的敏感性和特异性。Chueh等通过制备地高辛探针,成功建立了敏感荧光原位杂交技术,该方法采用原位RNA/RNA杂合体与抗地高辛抗体碱性磷酸酶结合,再用坚固红TR盐/萘酚As-MX磷酸盐显色,用显微镜观察,并认为该方法结果明显、清晰,对PRRS临床诊断及病毒持续感染研究有重要意义。

3.5 环介导等温扩增技术

Notomi等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法,即环介导等温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。张跃伟等建立了荧光显色在环介导等温扩增检测PRRSV的方法,该方法使用了针对靶序列M+N基因的1组引物,并且能在63 ℃等温条件下30 min内完成反应。在敏感性检测中RT-LAMP与RT-PCR都能检测103个包含靶基因片段的重组质粒。结果说明,应用荧光显色剂的RT-LAMP检测方法可快速检测PRRSV。鑫婷等建立了PRRSV RT-LAMP检测方法,试验结果表明,RT-LAMP检测方法可快速、灵敏、特异的检测PRRSV,并适用基层和现场检测,其他人Rovira等、Chen等也建立了类似的方法。LAMP是一种崭新的DNA扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点,具有替代PCR方法的可能性。

3.6 基因芯片检测技术

杨林等建立PRRSV基因芯片检测技术,其根据PRRSV的核衣壳蛋白编码基因序列设计了1对特异性引物P1/P2,扩增出大小为294 bp的目的条带;再根据目的片段,设计合成4条寡核苷酸探针,其中反向引物的5′端用荧光素CY3标记。以荧光标记不对称PCR技术为基础,通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对PRRSV的检测,建立PRRSV的基因芯片检测方法。利用该方法对39份猪组织样品进行检测,表明该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的,对PRRSV的快速诊断和分子流行病学调查具有重要意义。郭焕成等建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2缺失变异株与经典美洲型毒株基因芯片鉴别方法,设计扩增美洲型PRRSV保守序列和包含基因缺失区域的nsp2基因片段的二重PCR引物,并设计长度为31~35 bp的美洲型毒株通用寡核苷酸探针和非缺失株相对于变异株nsp2基因缺失区域的探针,建立寡核苷酸芯片方法。检测了该方法的特异性和灵敏度,并进行初步应用。结果通过杂交模式可清楚地区分经典毒株与缺失毒株;芯片探针与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒样品无非特异性杂交;芯片法与常规PCR法的灵敏度相近;对12份疑似高致病性PRRS猪样品的结果与普通PCR法一致。

由于当前PRRS给世界各国生猪养殖带来了巨大的经济损失,严重威胁了生猪养殖的发展,采用高效、特异、准确的检测技术对 PRRS进行诊断和控制有着重要的意义。而用于 PRRS检测的技术有多种多样,每一种检测方法均有其自身的优点与不足,现实的生产实践应用中应根据实际检测需要及实验条件等情况来选择相应的检测技术,从而为该病的诊断和防控措施的制订提供一定的依据。本文较详细地综述了目前常用的PRRSV的诊断方法与技术,不同的技术方法从不同方面对猪繁殖与呼吸综合征的诊断与防控提供了便利工具,大大加快了该病的防控步伐。随着相关研究在不断深入,许多新的诊断技术和方法还会不断涌现,这些都必将为今后的生猪养殖产业的发展带来更好的技术保障。

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